硫酸沃拉帕沙，作為首個PAR-1拮抗劑，于2014年通過了美國FDA的批準上市，可謂揭開了凝血酶受體拮抗劑的序幕，PAR-1拮抗劑也以一種全新的姿態登上了抗凝抗栓藥物的舞臺。在對PAR-1及其拮抗劑進行總結的時候，發現其“兄弟”PAR-4似乎存在潛在的研究意義，故總結此文，如若對君能有些許的幫助，那便是在下極大的榮幸。
1 蛋白酶激活受體PARs都有哪些成員？
蛋白酶激活受體(protease activated receptors，PARs)，是細胞表面的一種G蛋白偶聯受體，是G蛋白偶聯受體超家族的成員之一。同其他類型的G蛋白偶聯受體一樣，PARs也具有單鏈七次跨膜的特性。作為血小板中主要的受體之一，迄今為止，PARs共有四個蛋白激酶受體被發現，分別為PAR-1，PAR-2，PAR-3和PAR-4。人類血小板表達的是PAR-1和PAR-4，鼠科動物血小板表達的則是PAR-3和PAR-4，而不表達PAR-1。
人類血小板表達的PAR-1和PAR-4兩種凝血酶受體，是抗血栓藥物的靶標之一。2014年5月，PAR-1小分子拮抗劑Vorapaxar (商品名Zontivity)被FDA批準可用于預防血栓形成，是目前唯一一個通過拮抗凝血酶受體活性來治療血栓的藥物(化學結構及其作用見圖一)。然而，以PAR-1受體為靶標的抗血栓藥物常常會導致出血事故的發生，因此Vorapaxar不能用于腦出血患者。近些年，研究發現，通過拮抗PAR-4，出血事故的風險相對較低，因此PAR-4小分子拮抗劑被認為可能成為潛在的、安全有效的抗血栓藥物。
2 PAR-4的發現及其結構特征
初，kahn和xu于1998年發現了PAR-4，他們進一步克隆了PAR-4的基因并從淋巴瘤daudi細胞中得到了它的序列，全長共4.9kb。在結構上，PAR-4的N末端和C末端的氨基酸序列不同于其他的PARs，它和PAR-2的第4個跨膜區域有34%的同源性，由385個氨基酸組成，包含一個信號肽和1個胞外N末端Arg/Gly絲氨酸蛋白酶結合位點。PAR-1、PAR-2和PAR-3都緊密連接在人類染色體5q13上，而熒光原位雜交實驗顯示，人的PAR-4基因位于染色體19p12上。在結合位點方面，與PAR-1和PAR-3相比，PAR-4沒有促凝血酶結合的類水蛭素結合位點，對凝血酶的親和力低于PAR-1和PAR-3，所以，為了激活PAR-4，則需要更高濃度的凝血酶。
PAR-4的激活原理同PAR-1一樣：首先凝血酶與PAR-4胞外N末端結合，使N末端裂解產生新的N末端即系鎖配體，這個配體與胞外第二環結合形成閉環從而激活受體并引起一系列的信號通路(見圖二)。另外，人工合成的系鎖配體末端的多肽片段GYPGQC (hPAR-4)或AYPGKF (mPAR-4)也能直接激活PAR-4。在PAR-3轉染的COS7細胞中，PAR-3不能被凝血酶激活，也不存在PAR-3激動肽，然而當PAR-3和PAR-4同時被表達時，PAR-3被認作一個輔助因子在低濃度的凝血酶下提高了PAR-4對凝血酶的敏感度，有利于PAR-4的裂解和激活。在只有PAR-4的條件下由于PAR-4沒有類水蛭素的序列，故其在低濃度的凝血酶中裂解率很低。
3 除了與血栓有關，PAR-4還可能轉軌到哪些領域？
Northern blot顯示，PAR-4主要分布于肺、胰腺、甲狀腺、睪丸和小腸中，在消化道中適度表達。除了與血栓有關外，PAR-4還參與到其他一些重要環節，如調節血管活性、介導細胞因子、釋放炎癥介質和調節免疫系統等。PAR-4和G蛋白亞基間信號轉導的主要偶聯通路是通過G蛋白Gq來激活磷脂酶C(PLC)，導致三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DAG)的產生從而引起細胞內Ca2+動員以及蛋白激酶C(PKC)的活化。同時，PAR-4能被多種絲氨酸蛋白酶激活，在炎癥反應中起到調節水腫(通過激肽釋放酶-激肽系統)和募集中性粒細胞的作用。
除了與炎癥有關，PAR-4還與腫瘤相關。已有研究表明，PAR-4在腫瘤組織中的表達與正常組織相比有異常改變，并且與腫瘤惡性行為相關，例如在前列腺癌、乳腺癌、肝癌、星形膠質細胞瘤、肥大細胞白血病等多種惡性腫瘤中有高表達，而在胃癌、肺癌、食管鱗狀細胞癌等腫瘤中表達卻較低。在不同的惡性腫瘤中呈現截然不同的作用，說明其可能在腫瘤細胞的發生發展、侵襲轉移中通過不同的途徑而發揮作用。PAR-4在不同腫瘤組織中表達趨勢的不一致，甚至存在相反的結果，提示PAR-4在惡性腫瘤生物學行為中的機制較為復雜, 值得更進一步的深入研究。
4 PAR-4拮抗劑目前有哪些？
對于PAR-4，目前還沒有相應藥物上市，甚至幾乎沒有相關候選化合物的臨床信息。相對而言，化合物YD-3是目前研究較為深入的PAR-4小分子拮抗劑(化學結構見圖三)。YD-3是在2000年被發現的一個強效且具有選擇性的PAR-4拮抗劑，這個吲哚唑類化合物能選擇性地抑制PAR-4的激活，對PAR-4的IC50為130nM，對PAR-1的IC50為10μM。
通過研究表明，凝血酶誘導的纖維蛋白聚集不受YD-3的影響(即使在100μM濃度下)，聚集時間也不受影響，這表明YD-3不影響凝血酶的蛋白水解活性。YD-3通過濃度依賴的方式抑制PAR-4激動肽GYPGKF誘導的人血小板聚集，IC50 =0.13±0.02μM，而其抑制能力可通過提高凝血酶濃度來削弱。YD-3還抑制由PAR-4激動肽GYPGKF誘導的血小板聚集，但對PAR-1激動肽SFLLRN、凝血酶、膠原和U46619誘導的血小板激活沒有抑制作用。
在2013年，Vanderbilt Univeristy的Lindsley和Hamm研究小組發現了高活性且高選擇性的吲哚類化合物2.2，其對PAR-4的IC50值為66nM，對PAR-1的IC50值大于10μM。后國內有課題組從Vanderbilt Univeristy的小分子化合物庫篩選出160多個與其結構類似的吲哚類似物，并通過高通量活性篩選終發現了一個擁有新穎化學類型(chemotype)的PAR-4拮抗劑ML354，其對PAR-4的IC50值為140nM，對PAR-1的IC50值約為10μM。相對而言，化合物2.2與ML354值得進一步的深入研究。(2.2與ML354的結構式見圖四)。
小結
首先，不管怎么說，PAR-1拮抗劑硫酸沃拉帕沙的上市，為該類藥物的發展邁開了堅實的一步。不過，出血風險的存在勢必會對該類藥物的發展起到限制的作用。藥物在發現的過程中，靶點強勁 + 對應的化合物活性強，并不等于產生療效“佳”的藥物，PAR-4相對于PAR-1也許正如此。倘若說，靶點適度的PAR-4已經確定，那么，相關拮抗劑的開發及其療效的進一步探索，是否應該加快腳步呢！
